Northern Blot ist eine Labortechnik, die zur Untersuchung von Genexpressionmustern durch Erkennung und Analyse von RNA-Molekülen verwendet wird. Der Name "Northern Blot" leitet sich von der Ähnlichkeit mit der Southern-Blot-Technik ab, die zur DNA-Analyse eingesetzt wird. Mit der Northern-Blot-Methode können Forscher das Vorhandensein, die Größe und die Häufigkeit spezifischer RNA-Moleküle in einer Probe bestimmen.
Die grundlegenden Schritte beim Northern Blot sind wie folgt:
- RNA-Extraktion: Die Gesamt-RNA wird mithilfe von Methoden wie der Phenol-Chloroform-Extraktion oder kommerziellen RNA-Extraktionskits aus Zellen oder Geweben isoliert. Die extrahierte RNA kann verschiedene Arten von RNA umfassen, wie etwa Messenger-RNA (mRNA), ribosomale RNA (rRNA) und Transfer-RNA (tRNA).
- RNA-Denaturierung: Die extrahierte RNA wird durch Hitze oder chemische Denaturierungsmittel denaturiert, um die Wasserstoffbrückenbindungen aufzubrechen und die RNA-Moleküle in eine einzelsträngige Form umzuwandeln.
- Gelelektrophorese: Die denaturierten RNA-Proben werden mittels Gelelektrophorese nach ihrer Größe aufgetrennt. Typischerweise wird für das Northern-Blotting Agarosegel verwendet, und die RNA-Proben werden in die Vertiefungen des Gels geladen und einem elektrischen Feld ausgesetzt. Die RNA-Moleküle wandern entsprechend ihrer Größe durch das Gel, wobei kleinere Moleküle sich schneller bewegen als größere.
- Übertragung auf die Membran: Nach der Gelelektrophorese werden die getrennten RNA-Moleküle vom Gel auf eine feste Trägermembran übertragen (geblottet), typischerweise aus Nitrozellulose oder Nylon. Diese Übertragung kann durch Kapillarwirkung oder durch Verwendung eines Vakuumgeräts erreicht werden.
- Hybridisierung: Die übertragene RNA auf der Membran wird dann mit einer markierten RNA- oder DNA-Sonde hybridisiert. Die Sonde ist eine komplementäre Sequenz, die spezifisch an die gewünschte Ziel-RNA binden kann. Zum Nachweis wird die Sonde üblicherweise mit einem radioaktiven Isotop (z. B. 32P) oder einem nicht radioaktiven Marker (z. B. Biotin oder Digoxigenin) markiert.
- Waschen und Detektion: Nach der Hybridisierung wird die Membran gewaschen, um jegliche ungebundene Sonde zu entfernen. Der Nachweis der gebundenen Sonde erfolgt entweder durch Autoradiographie (für radioaktive Sonden) oder durch Chemilumineszenz-/Fluoreszenzmethoden (für nicht radioaktive Sonden). Dieser Schritt ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung der Ziel-RNA-Banden auf der Membran.