Hauptunterschied - Northern vs Southern vs Western Blot (2023)

Der Nachweis spezifischer Sequenzen von DNA, RNA und Proteinen ist für verschiedene Arten von Studien in der Molekularbiologie von wesentlicher Bedeutung. Die Gelelektrophorese ist eine Technik, bei der DNA, RNA und Proteine ​​nach ihrer Größe getrennt werden. Aus den Gelprofilen werden bestimmte DNA-Sequenzen, RNA-Sequenzen oder Proteine ​​durch die speziellen Techniken nachgewiesen, die als Blotting und Hybridisierung mit markierten Sonden bezeichnet werden. Es gibt drei verschiedene Arten von Blotting-Methoden, nämlich Southern, Northern und Western. Der Hauptunterschied zwischen Northern, Southern und Western Blot liegt in der Art des Moleküls, das es aus einer Probe nachweist.

Was ist Southern Blotting?

Die Southern-Blot-Technik wurde 1975 von E. M. Southern zur Identifizierung einer spezifischen DNA-Sequenz aus einer DNA-Probe entwickelt. Dies ist die erste in der Molekularbiologie eingeführte Blotting-Technik. Es ermöglichte den Nachweis spezifischer Gene aus der DNA, spezifischer Fragmente aus der DNA usw. Die Southern-Blot-Technik umfasst mehrere Schritte:

1. DNA wird aus der Probe isoliert und mit Restriktionsendonukleasen verdaut.
2. Die verdaute Probe wird durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt.
3. DNA-Fragmente im Gel werden unter Verwendung einer alkalischen Lösung zu Einzelsträngen denaturiert.
4. Einzelsträngige DNA wird durch Kapillartransfer auf eine Nitrocellulosefiltermembran übertragen.
5. Übertragene DNA wird dauerhaft auf der Membran fixiert.
6. Fixierte DNA auf der Membran wird mit markierten Sonden hybridisiert.
7. Ungebundene DNA wird durch Waschen von der Membran abgewaschen.
8. Der Röntgenfilm wird der Membran ausgesetzt und ein Autoradiogramm wird erstellt.

Southern Blot wird für verschiedene Aspekte der Molekularbiologie angewendet, wie z.B. RFLP-Kartierung, forensische Studien, DNA-Methylierung, Genexpression, Nachweis mutierter Gene bei genetischen Störungen und DNA-Fingerprinting.

Was ist Northern Blotting?

Northern Blot ist eine Methode zum Nachweis einer bestimmten RNA-Sequenz oder mRNA-Sequenz aus einer Probe zur Untersuchung der Genexpression. Diese Technik wurde 1979 von Alwine, Kemp und Stark entwickelt. Die Northern-Blot-Technik wird wie folgt durchgeführt:

1. Die RNA wird aus der Probe extrahiert und durch Gelelektrophorese aufgetrennt.
2. Die RNA wird vom Gel auf eine Blotmembran übertragen und fixiert.
3. Die Membran wird mit einer markierten Sonde behandelt, die aus cDNA oder RNA hergestellt wurde (die Sonde ist komplementär zu einer bestimmten Sequenz in der Probe).
4. Die Sonde wird mit der Membran inkubiert, um an eine bestimmte Sequenz zu binden.
5. Ungebundene Sonden werden abgewaschen.
6. Hybridisierte Fragmente werden durch ein Autoradiogramm nachgewiesen.

Northern Blot ist ein wichtiges Instrument zum Nachweis und zur Quantifizierung von hybridisierter mRNA, zur Untersuchung des RNA-Abbaus, zur Bewertung der RNA-Halbwertszeit, zum Nachweis des RNA-Spleißens und zur Untersuchung der Genexpression.

Was ist Western Blot?

Western Blot ist ein Verfahren zum Nachweis eines spezifischen Proteins aus einer Proteinmischung unter Verwendung eines markierten Antikörpers. Daher ist Western Blot auch als Immunoblot bekannt. Diese Technik wurde 1979 von Towbin et al. eingeführt und wird heute routinemäßig in Labors für die Proteinanalyse durchgeführt. Die Schritte sind wie folgt:

1. Proteine ​​werden aus der Probe extrahiert.
2. Proteine ​​werden durch ihre Größe unter Verwendung von Polyacrylamidgelelektrophorese getrennt.
3. Getrennte Moleküle werden durch Elektroporation in eine PVDF-Membran oder eine Nitrocellulosemembran übertragen.
4. Die Membran wird für eine unspezifische Bindung mit den Antikörpern blockiert.
5. Übertragene Proteine ​​werden mit primären Antikörpern (enzymmarkierten Antikörpern) gebunden.
6. Die Membran wird gewaschen, um unspezifisch gebundene Primärantikörper zu entfernen.
7. Gebundene Antikörper werden durch Zugabe eines Substrats und Nachweis des gebildeten gefärbten Niederschlags nachgewiesen.

Western Blot ist nützlich beim Nachweis von spezifischen Proteinen in einer Proteinmischung und wird in verschiedenen Bereichen wie der medizinischen Diagnostik, der biomedizinischen Forschung und der Lebensmittelanalytik eingesetzt.

Zusammenfassung - Northern vs Southern vs Western Blot

Blotting ist eine spezielle Technik, die zur Identifizierung spezifischer DNA, RNA oder Proteine ​​aus den Proben entwickelt wurde. Es gibt drei separate Blot-Verfahren, nämlich Nord-, Süd- und West-Blot-Verfahren, um einen bestimmten Molekültyp nachzuweisen. Die Northern-Blot-Technik dient zum Nachweis einer spezifischen RNA-Sequenz aus einer RNA-Mischung. Die Southern-Blot-Technik ermöglicht den Nachweis einer bestimmten DNA-Sequenz aus einer DNA-Probe, und die Western-Blot-Technik wurde entwickelt, um ein spezifisches Protein aus einer Proteinmischung zu identifizieren. Jede dieser Techniken hat ihre eigenen Anwendungen und ist in der Molekularbiologie von großer Bedeutung.

Referenzen:

1. Gibbons, Janay. "Western Blot: Überblick über den Proteintransfer." Nordamerikanisches Journal of Medical Sciences. Medknow Publications & Media Pvt Ltd, März 2014.
2. Brown, T. "Southern Blot". Aktuelle Protokolle in der Immunologie. US National Library of Medicine, Mai 2001.
3. Er, Shan L. "Northern Blot". Methoden in der Enzymologie. US National Library of Medicine, 2013.